«Наука и жизнь» № 9, 2005 г., , стр. 16 – 21,
http://www.nkj.ru/archive/articles/1690/

НАУКА. ДАЛЬНИЙ ПОИСК

Моделирование пространственной структуры белков – не простая задача. Чтобы ускорить сложные расчёты, исследователи используют программу распределённых вычислений. Это позволяет привлечь к участию в проекте сотни тысяч компьютеров, в том числе домашних. Трёхмерная модель белка, над которой идёт работа, появляется на экране монитора в качестве заставки.

РУКОТВОРНАЯ ЖИЗНЬ

Человек давно научился синтезировать сложнейшие молекулы, создавать новые материалы, оперировать отдельными атомами. Теперь учёные пытаются создать в лабораторных условиях живые организмы, пока что самые простые, а также их отдельные, но очень существенные «детали».

А. ЧУБЕНКО, биолог (Санкт-Петербург)

СПОСОБ СУЩЕСТВОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ ТЕЛ

Синтез белков – дело нехитрое. В самом примитивном варианте для этого достаточно нагреть смесь сухих аминокислот до 150°С. Через несколько часов образуются цепочки полипептидов длиной до 250 аминокислотных остатков, часть из которых проявляет слабую ферментативную активность. В колбы желательно добавить глину: её частицы адсорбируют аминокислоты и работают как катализатор. Чтобы получить таким способом примитивную живую клетку, необходимы сущие «пустяки» – несколько миллиардов колб и несколько миллиардов лет.

В 2004 году, примерно через четыре миллиарда лет после появления на Земле первых полинуклеотидных и полипептидных цепочек, их потомки из Медицинского института Ховарда Хьюза при Университете Вашингтона под руководством Дэвида Бейкера синтезировали первый рукотворный белок Top7. В отличие от природы, действующей методом проб и ошибок, учёные сначала смоделировали белок на компьютере, от последовательности аминокислот до трёхмерной структуры молекулы, а затем чисто химическим путём, без генов и рибосом, синтезировали последовательность из нескольких десятков аминокислот.

Цепочка аминокислот – это только полуфабрикат. Свойства белков определяет не столько их химический состав, сколько трёхмерная структура их молекул.

Чтобы воспроизвести процесс, с которым живая клетка справляется за считанные минуты, синтезируя тысячи, а то и десятки тысяч молекул одновременно, коллективу учёных потребовались годы. Только моделирование фолдинга – сворачивания молекулы белка в трёхмерную структуру – на одном компьютере заняло бы около ста лет, и для расчётов использовали программу Folding@Home – один из крупнейших проектов распределённых вычислений: на момент окончания расчетов по Top7 в нём участвовало более полумиллиона компьютеров. Программа работает в фоновом режиме, практически не влияя на общую производительность процессора.

Если вы относитесь к числу счастливчиков, имеющих неограниченный доступ к Интернету, – присоединяйтесь. Число вакансий не ограничено. Методику авторы собираются использовать для исследования белков (в первую очередь – бета-амилоида, накопление которого происходит при болезни Альцгеймера) и для конструирования белков с заданными свойствами, необходимых медицине.

ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКАЯ ПОЛУЖИЗНЬ

Самая примитивная жизнь – это вирус, а самая примитивная из известных вирусоподобных частиц с длинным названием «вироид кокосовой пальмы каданг-каданг» состоит всего из 246 нуклеотидов. Однонитевое кольцо РНК вироидов не содержит даже истинных генов, кодирующих белки. Соответственно у них нет белковой оболочки, позволяющей ввести генетический материал через неповреждённую клеточную стенку.

Геном наиболее простых вирусов содержит всего три гена, которые кодируют белки, необходимые для воспроизводства: белок, вызывающий разрыв клеточной стенки хозяина; фермент, обеспечивающий многократную репликацию своего генома, и белок капсида – оболочки, покрывающей вирусную ДНК или РНК. Пример такого вируса – бактериофаг Qβ, инфицирующий кишечную палочку Escherichia coli. Его РНК состоит примерно из 3500 нуклеотидов. Самые большие вирусы содержат две-три сотни генов, закодированных в двухцепочечной нити ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов.

Методы производства искусственных вирусов уже разработаны: для этого нужно запрограммировать последовательность нуклеотидов, синтезировать отдельные участки ДНК или РНК длиной в несколько десятков нуклеотидов и соединить их между собой.

Первый синтетический вирус создала группа исследователей из Университета штата Нью-Йорк под руководством Экарда Виммера. На самом деле этот вирус был во всех отношениях полусинтетическим. Во-первых, это было не что-то новое, а точная копия натурального вируса полиомиелита. Во-вторых, участок РНК или ДНК, содержащий нужную последовательность нуклеотидов, – примерно то же самое, что дискета, на которой записана программа для автоматизированной производственной линии. Считывание информации, синтез новых копий вирусной РНК и белков капсида и сборка вирусных частиц – сложный процесс, для которого вирус использует ферменты и органеллы клетки-хозяина. Чисто химическими методами теоретически можно синтезировать и РНК полиовируса (примерно семь тысяч нуклеотидов), и каждый из входящих в капсид белков, но собрать их в единую конструкцию без помощи живой клетки невозможно. Попробуйте (разумеется, мысленно) разобрать на детали что-нибудь несложное вроде зажигалки или шариковой ручки, сложить детали в коробку и трясти, пока они не соберутся в действующее изделие.

Для синтеза РНК вируса группа Виммера использовала натуральные клеточные ферменты; для синтеза белков и сборки вирусных частиц – экстракты из живых клеток, содержащие необходимые для синтеза компонентов и сборки вирусов рибосомы, ферменты, нуклеотиды, аминокислоты, транспортные РНК и т. д.

В ноябре 2003 года исследовательская группа из Института альтернативных биологических источников энергии под руководством знаменитого Крейга Вентера (основателя и бывшего руководителя компании «Селера джиномикс», прославившейся успехами в расшифровке генома человека) объявила о новом достижении. Учёным удалось реконструировать бактериофаг φX174, кольцевая одноцепочечная ДНК которого содержит 11 генов в последовательности из 5386 нуклеотидов. Виммеру на синтез полиовируса потребовалось три года; Вентер и его коллеги после годичной подготовки собрали вирус за две недели. Введённый в бактерию, синтетический вирус нормально размножался, а его потомки самостоятельно заражали клетки кишечной палочки.

Одно из наиболее очевидных применений синтетических вирусов – создание бактериофагов, способных убивать болезнетворные бактерии. Такие вирусы будут лучшим средством борьбы с инфекциями, чем антибиотики. Полностью искусственные или генетически модифицированные вирусы можно использовать и для доставки генов в хромосомы при генной инженерии и генетической терапии наследственных болезней.

Бактериофаг φX174 (на рисунке представлена его объёмная модель) содержит всего 11 генов. Относительная простота этого микроорганизма позволила американским учёным под руководством Крейга Вентера «собрать» его в лаборатории из отдельных «деталей».		Микроорганизм Mycoplasma genitalium, представленный на фотографии, сделанной с помощью электронного микроскопа, содержит всего 517 генов, из которых лишь 300 имеют критическое значение для выживания в лабораторных условиях. Именно этот организм стал прототипом синтетической «минимальной клетки», над созданием которой работают учёные.

МИНИМИЗИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ

Сейчас Вентер и его коллеги, в число которых входит лауреат Нобелевской премии Хэмилтон Смит, работают над созданием – с помощью той же технологии искусственного микроорганизма на основе Mycoplasma genitalium – условно-патогенного обитателя мочеполовых путей. Хромосома средней бактериальной клетки содержит две-четыре тысячи генов. Геном M. genitalium состоит всего из 517 генов, 480 из которых кодируют белки, а 37 – различные молекулы РНК. Ближайший родственник M. genitalium, M. pneumoniae, содержит те же 480 генов плюс ещё около 200 дополнительных. Для выживания простейшей «версии» микроорганизма эти гены не являются обязательными. Аккуратно, один за другим, вырезая гены из хромосомы M. genitalium, исследователи установили, что в её лаконичном геноме только около 300 генов действительно необходимы для существования бактерии в питательном бульоне.

Проект «Минимальный геном» направлен на создание простейшего из простейших жизнеспособного одноклеточного организма. После этого можно будет проводить «апгрейдинг устройства с минимальной конфигурацией». В обычной бактериальной клетке избыточная продукция естественных метаболитов или синтез белка, закодированного в трансгене, конфликтует с основными программами, записанными в тысячах генов и обеспечивающими выживание клетки в природных условиях. В клетке с минимальным геномом все ресурсы, кроме необходимых для жизни и деления в тепличных условиях биореактора, будут направлены на синтез необходимых человеку белков.

Работы Вентера и Смита финансируются специальным грантом Министерства энергетики США в размере 3 млн долларов. Министерство рассчитывает, что со временем проект будет иметь практический выход, например для создания новых микроорганизмов, способных перерабатывать токсические отходы производства или вырабатывать водород и другие виды топлива.

НАБОР «СДЕЛАЙ САМ»

Учёные из нью-йоркского Университета имени Рокфеллера под руководством Альберта Либхабера и Винсента Нуаро подошли к конструированию искусственной клетки с другой стороны. Они не уменьшают существующий геном, а конструируют клетку «с нуля». Теоретически все составные части действующей модели клетки можно было бы синтезировать из простых органических молекул, но проще взять детали из живых источников.

Вначале в двухслойную оболочку из фосфолипидов, выделенных из куриного яйца, исследователи ввели гомогенизированное клеточное содержимое кишечной палочки (за исключением хромосомы и плазмид). Кроме того, во внутреннюю среду искусственных клеток добавили полученный из вируса фермент, обеспечивающий синтез ДНК. Но сама по себе фосфолипидная оболочка у живых клеток служит только каркасом клеточных мембран, а двусторонний транспорт веществ через мембраны обеспечивает сложный комплекс белковых молекул. И для процессов клеточного синтеза необходима руководящая и направляющая роль хромосомы. Без неё везикулы (микропузырьки) первой модели могли существовать не больше пяти часов, после чего транспорт аминокислот и рибонуклеотидов через фосфолипидную стенку и синтез из них белков и обрывков нуклеиновых кислот прекращались.

Экспериментаторы добавили в содержимое везикул фрагменты ДНК. Выделенный из медузы ген зелёного флуоресцирующего протеина часто используют в качестве маркера: если клетки светятся, значит, трансгенная конструкция встроена в хромосому и дополнительные гены обрабатываются как свои. Второй ген, выделенный из золотистого стафилококка, кодирует трубчатые молекулы белка альфа-гемолизина. Этот белок встраивался в фосфолипидный бислой, и образовавшиеся отверстия обеспечивали транспорт веществ через мембрану. В результате псевдожизнь искусственных клеток удлинилась до четырех суток. За их «гибелью» можно было следить по прекращению свечения.

В 2004 году только в США созданием искусственной жизни занимались более 100 лабораторий, а Европейский союз выделил 9 млн долларов на проект «Программируемая эволюция искусственной клетки», в том числе на открытие в Венеции первого института по созданию искусственной жизни – Европейского центра живых технологий.

ГЕНЫ ПО РЕЦЕПТУ

Генетически модифицированные животные, от светящихся аквариумных рыбок до коз и коров, доящихся «очеловеченным» молоком с повышенным в тысячу раз содержанием железа, уже перестали вызывать мистический трепет. И даже генетическая модификация человека – уже состоявшийся факт.

Правда, до реальной возможности появления подвидов Homo novus, избавленных от многих недостатков Homo sapiens и даже приспособленных для выполнения определённых работ, ещё далеко, хотя в прогнозах футурологов всерьёз обсуждаются более-менее реальные усовершенствования, которые неплохо было бы ввести в человеческий организм, а в фантастических романах можно найти сотни вариантов модифицированных людей, в том числе и явно юмористических, вроде четвероруких космических монтажников или сантехников с пальцами, заменяющими гаечные ключи.

Но прежде чем придавать человеку новые полезные свойства, следует избавить его от старых и вредных. И не всё человечество сразу, а отдельных его представителей, которым особенно не повезло с генами.

По достаточно осторожным оценкам, половина всех хронических болезней, которыми годам к пятидесяти обзаводится каждый из нас, имеют наследственную природу. Предрасположенность ко многим обычным болезням, от артрита до язвы, обусловлена сочетанием особенностей более-менее обычных отклонений во множестве генов. Попытки исправить их – дело безнадёжное, во всяком случае – в обозримом будущем.

Но многие болезни являются следствием мутации в одном-единственном гене, в результате чего нарушается или полностью отсутствует синтез закодированного в этом гене белка. Вероятность рождения ребёнка с одной из таких болезней может быть довольно высокой: семейная гиперхолестеролемия, приводящая к развитию тяжёлого атеросклероза в раннем возрасте, встречается у одного человека из 500, серповидноклеточная анемия – у одного из 400 чистокровных африканцев. Реже всего (примерно у одного из ста миллионов новорождённых) встречается прогерия – болезнь, при которой в 7 – 10 лет ребёнок начинает катастрофически быстро стареть и через несколько лет умирает от старости. Суммарная вероятность рождения ребёнка с одной из известных моногенных болезней составляет около одного процента. Если прибавить к этому вероятность в течение жизни заболеть одной из тех болезней, для которых доказана роль определённой модификации определённого гена, станет ясно, почему разработкой методов генотерапии занимаются сотни лабораторий, а клинические испытания уже проходят сотни методик генетической терапии различных видов злокачественных новообразований, гемофилии, СПИДа, муковисцидоза, гиперхолестеролемии, бокового амиотрофического склероза и десятков других болезней.

Лучший вектор (средство доставки) генов в ДНК человека и других животных – это непатогенные или обезвреженные вирусы.

В июне 2005 года появилось сообщение, что в Пенсильванском университете (США) создан гибрид двух смертельно опасных вирусов, предназначенный для генной терапии муковисцидоза – неизлечимого наследственного заболевания. Для этого тяжёлого заболевания характерна повышенная вязкость слизи, в частности в бронхах и кишечнике, что приводит к нарушению работы многих органов и прежде всего систем дыхания и пищеварения. Виновник муковисцидоза – ген, который кодирует производство белка, регулирующего прохождение ионов натрия и хлора через клеточную мембрану. Чтобы остановить болезнь, необходимо скорректировать дефектный ген в значительном числе клеток. Было решено использовать для этого вирус иммунодефицита человека, который умеет добавлять гены в ДНК клеток. Естественно, вирус модифицировали таким образом, чтобы он не мог размножаться и вызывать СПИД. Однако сам по себе вирус иммунодефицита не способен проникать в клетки лёгочного эпителия, которые более других нуждаются в генетическом лечении. Чтобы правильно нацелить его, использовали белковую оболочку вируса Эбола, умеющего соединяться с нужными клетками. Испытания на мышах и обезьянах показали высокую эффективность гибридного вируса: правильный ген удалось внедрить почти в четверть клеток лёгочного эпителия. Однако излечиться раз и навсегда таким способом невозможно. Вирус исправляет геном только в поверхностных клетках легочного эпителия, и лечение необходимо повторять несколько раз в год, по мере отмирания клеток.

Искусственные клетки-везикулы, состоящие из фосфолипидной пористой оболочки, внутри которой заключены фрагменты ДНК медузы, способны светиться зелёным светом. Это свечение служит доказательством того, что внутри искусственных клеток идёт синтез белка.		Организм детей с врождённым тяжёлым комбинированным иммунодефицитом беззащитен перед любой инфекцией, поэтому ребёнок может выжить только в стерильном боксе. Американский мальчик Дэвид Веттер, родившийся в 1971 году, провёл в пластиковом «пузыре» 12 лет, после чего ему сделали пересадку костного мозга – к сожалению, неудачно. Генная терапия даёт таким детям надежду на выздоровление.

При синдроме тяжёлого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) из-за нарушения синтеза фермента аденозиндезаминазы в организме накапливаются аденозин и дезоксиаденозин, токсическое действие которых приводит к гибели Т- и В-лимфоцитов. Таких больных называют «дети в пузыре»: без лечения для них смертельна любая инфекция, и единственный способ продлить их жизнь, кроме генотерапии, – это полная изоляция от внешнего мира в стерильной камере. Частота заболевания – примерно один из миллиона новорождённых. Первая попытка лечения двух девочек, больных ТКИДом, была предпринята в 1990 году: в хромосомы их собственных Т-лимфоцитов ввели ген аденозиндезаминазы, модифицированные клетки размножили и ввели в костный мозг пациенток. К сожалению, единственный доступный метод доставки генов в лимфоциты или кроветворные стволовые клетки – с помощью ретровируса – у двоих из дюжины пролеченных таким способом детей вызвал рак крови. Правда, после всестороннего обсуждения большинство специалистов решили, что риск в данном случае оправдан: гарантия смерти при отсутствии лечения – это ещё хуже, чем вероятность лейкоза.

Для доставки терапевтических генов в клетки применяют также конструкции на основе аденовирусов (лейкозом они не грозят, но могут вызвать выраженный иммунный ответ и гибель клеток, получивших терапевтический ген). При заболеваниях нервной системы (некоторые опухоли, болезни Альцгеймера и Паркинсона, рассеянный склероз и другие болезни, связанные с нарушением синтеза определённого белка) хорошим средством доставки генов может служить обезвреженный вирус герпеса. Он легко заражает клетки нервной ткани и, в отличие от «дикого» типа, не вызывает ни опоясывающего лишая, ни энцефалита.

Звучит всё это и обнадеживающе, и в то же время жутковато: как бы вирусы, даже модифицированные, не привели к нежелательным побочным эффектам.

Невирусных способов доставки генов в клетки существует много. Клонированные в бактериальных плазмидах гены можно вводить прямо в ткани с помощью инъекций. Можно бомбардировать клетки кожи (или, через разрез, более глубокие ткани) с помощью генного «ружья» микрочастицами золота, к которым присоединены участки ДНК. Можно вводить отрезки ДНК в липосомы, которые полностью поглощаются клетками, или соединять с антителами, специфичными к белкам нужного типа клеток (например, раковых). Но при всех этих методах в ядра клеток попадает лишь ничтожная часть лечебных генов, а в хромосомы такие гены практически не встраиваются – соответственно и нужный белок синтезируется очень недолго.

Но зачем вообще встраивать новые гены в ветхие хромосомы? Ведь можно без вирусов, генных ружей и тому подобного построить новые хромосомы и уже их ввести в клетки!

МИКРОХРОМОСОМЫ ДЛЯ МИКРООРГАНИЗМА

	На фото белой стрелкой показана искусственная мини-хромосома (пока без истинных генов, кодирующих белки). На её создание исследователям из Мельбурна (Австралия) потребовалось 10 лет. Такие мини-хромосомы считаются весьма перспективными для доставки в клетку нужных генов.

Как и при конструировании искусственных клеток, при создании микрохромосом человека и животных исследователи применяют два противоположных подхода. Первый подход – это создание искусственных хромосом «с нуля», с помощью синтеза. По такому пути идут большинство научных групп, работающих в этой области. Другой подход предполагает, что основу искусственных хромосом составляют элементы нормальной хромосомы животных, например мыши.

Искусственные хромосомы дрожжей применяются в молекулярной биологии уже давно, главным образом для клонирования (получения множества идентичных копий) генов других эукариотических организмов. Первые искусственные хромосомы человека появились в конце XX века. Такая хромосома должна содержать служебные элементы: теломеры (концевые участки, играющие важную роль в репликации ДНК), точки инициации репликации (удвоения хромосом) и центромеру (структуру, к которой при делении клетки прикрепляются нити, растягивающие парные хромосомы). Всё остальное – терапевтические гены, один или больше, или несколько копий одного гена, чтобы синтез закодированного в нём белка шёл интенсивнее.

И в культуре клеток, и в организме искусственные хромосомы ведут себя так же, как обычные: они удваиваются при делении клеток и сохраняются у всех потомков исходной клетки. Клетка не делает разницы между своими и «приёмными» хромосомами, и закодированный в дополнительных хромосомах белок исправно синтезируется.

В одном из опытов в кроветворные стволовые клетки мыши ввели искусственные хромосомы, несущие ген эритропоэтина – белка, который способствует образованию эритроцитов и применяется при лечении анемий. Контрольной группе мышей ввели клетки с такими же дополнительными хромосомами, но «пустыми», содержащими только служебные гены. Как и ожидалось, у мышей опытной группы содержание эритроцитов в крови было значительно выше по сравнению с животными контрольной группы.

Создание искусственных хромосом человека, несущих правильную версию гена для лечения наследственных заболеваний (или гены терапевтических белков в случае ненаследственных болезней), – дело ближайшего будущего. Ряд исследователей расценивают искусственные хромосомы как самый многообещающий метод применения ген-модифицированных стволовых клеток для лечения заболеваний человека.

Вводить хромосомы в ядро можно будет либо заключив их в контейнеры-липосомы, либо с помощью инъекций иглой атомно-силового микроскопа. Японские нанотехнологи в ноябрьском номере журнала «Nano Letters» за 2004 год опубликовали статью, в которой описан зонд длиной 8 микрометров и шириной 200 нанометров. В оболочке ядра клетки после прокола такой иглой образуется брешь диаметром 1 микрометр, которая исчезает после извлечения иглы. Таким способом можно проводить нанохирургические операции с генетическим материалом непосредственно в живых клетках без нарушения целостности их микроструктур.

Разумеется, прежде чем вводить в организм человека клетки с добавочной парой хромосом, этот метод следует тщательно проверить на животных. И вообще, с возможностями генной инженерии и клеточной терапии связаны как большие надежды, так и серьёзные опасения: любое открытие, начиная с дубины и огня, люди ухитрялись использовать не только на пользу, но и во вред ближнему своему, другим божьим созданиям и биосфере в целом. Но до сих пор баланс добра и зла от умножения знания был положительным – давайте экстраполируем эту тенденцию и оставим за кадром возможные негативные последствия развития биотехнологии.

Более подробную информацию см. на сайте http://www.cbio.ru